Содержание материала

В клетках ЦНС

 
Рис. 8. Культуры клеток из тканей головного и спинного мозга белкообразной обезьяны с экспериментально воспроизведенным амиотрофическим лейкоспонгиозом:
а — вакуолизация цитоплазмы клеток спинного мозга (2-й пассаж,X 120); б — базофильные включения в цитоплазме клеток коры больших полушарий мозга (2-й пассаж, X 120); в — цитопатические изменения в культуре клеток спинного мозга (4-й пассаж, X 120); г — полная цитодеструкция клеток спинного мозга (5-й пассаж, X 120).
Окраска гематоксилином и эозином.

Для выделения агента амиотрофического лейкоспонгиоза и изучения его свойств нами использовались культуры клеток из мозга больных, умерших от амиотрофического лейкоспонгиоза, и животных с экспериментально воспроизведенным заболеванием. Кроме того, исследовали соответствующие контрольные культуры клеток мозга. Всего — 42 различных культуры клеток ЦНС.
При длительном культивировании культуры клетки из мозга больных, умерших от амиотрофического лейкоспонгиоза, и животных с экспериментальной инфекцией образовывали монослой в 1,5 раза быстрее, чем контрольные культуры клеток. Под световым микроскопом монослой клеток выглядел плотнее, чем в контрольной культуре, клетки тесно прилегали одна к другой. В некоторых культурах клеток, начиная с 3—5-го пассажа, в монослое появлялись увеличенные клетки с утонченными и укороченными отростками. Иногда в цитоплазме этих клеток возникали множественные вакуоли и базофильные включения (рис. 8). Несмотря на то, что в контрольных культурах клеток таких изменений не обнаружено, полученных данных недостаточно, чтобы признать эти изменения следствием: персистенции агента амиотрофического лейкоспонгиоза в системе in vitro.
В связи с возможным присутствием в этих культурах клеток обычных вирусов культуры были исследованы дополнительно. Методом флюоресцирующих антител в них не выявлены антигены вируса гриппа А и В, парагриппа типов 1, 2, 3, респираторно-синцитиального вируса, аденовируса, арбовируса, вирусов простого герпеса и цитомегаловируса, вируса желтой лихорадки, денго II, Гуам, Буньямвера, вилюйского энцефалита лошадей. Однако в культурах клеток из мозга одной из белкообразных обезьян и 4 морских свинок с воспроизведенным амиотрофическим лейкоспонгиозом обнаружены антигены вируса простого герпеса (ВПГ), аденовируса, парагриппа 2, цитомегаловируса. Персистенция этих вирусов в культурах клеток, по-видимому, является результатом контаминации исследованных культур клеток в процессе культивирования. В последующем в культуре клеток мозга белкообразной обезьяны, контаминированной ВПГ, отмечены цитодеструктивные изменения. Из-за невозможности приготовить новые культуры клеток из мозга белкообразных обезьян мы вынуждены были продолжить наблюдение за имеющейся. Однако для деконтаминации культуральной жидкости от этой линии клеток, используемой для пассирования агента амиотрофического лейкоспонгиоза на других линиях клеток и животных, ее подвергали термообработке при 100 °C в течение 10 мин. Помимо описанных выше особенностей исследуемых культур клеток в 24 случаях (57,1 %) развился феномен гемадсорбции с эритроцитами человека группы О (I) и макаки-резус, не связанный с присутствием этих вирусов.
Следовательно, в зараженных агентом АЛ первичных культурах клеток мозга повышается митотическая активность клеток, иногда меняются их морфологические признаки (клетки увеличиваются в размерах, в их цитоплазме образуются вакуоли и базофильные включения), появляется феномен гемадсорбции с эритроцитами человека группы 0 (I) и макаки-резус.
В дальнейшем была изучена возможность персистенции агента амиотрофического лейкоспонгиоза в гетерологичных диссоциированных культурах клеток нейронов. Для этого в 7- и 20-дневного диссоциированные культуры клеток нейронов спинного и головного мозга эмбрионов крысы вносили агент амиотрофического лейкоспонгиоза. За зараженными и соответствующими контрольными культурами клеток наблюдали в течение 7 дней. Никаких различий в структуре клеток в опыте и контроле на световом уровне не выявлено. Непрямым иммунопероксидазным методом (НИПМ) с использованием антисыворотки к РrР 27—32 кД АЛ в некоторых из этих зараженных клеток был обнаружен агент амиотрофического лейкоспонгиоза. 13 клетках спинного мозга агент амиотрофического лейкоспонгиоза выявляется чаще, чем в клетках головного мозга,— в 9 из 12 и 3 из 9 наблюдений соответственно. Установлено, что в культурах клеток спинного мозга агент амиотрофического лейкоспонгиоза чаще всего присутствует в мотонейронах и клетках глии, в чувствительных нейронах — значительно реже и ни разу он не был обнаружен в клетках спинального ганглия. В культурах клеток головного мозга одинаково поражаются нейроны и клетки глии (рис. 9).
С целью подтверждения способности агента амиотрофического лейкоспонгиоза размножаться в этих культурах клеток культуральной жидкостью и гомогенатом клеток, взятыми в разное время культивирования зараженных культур, были заражены морские свинки.
Из данных, представленных в таблице 4, видно, что АЛ чаще удавалось воспроизвести после введения животным гомогената клеток и лишь иногда — после инъекции культуральной жидкости. Если гомогенатом клеток спинного мозга, приготовленным через сутки после заражения их агентом, АЛ был воспроизведен только у 1 из 3 животных, а после введения культуральной жидкости ни одна из 3 морских свинок не заболела, то гомогенатом клеток и культуральной жидкостью, взятыми на 7-е сутки культивирования, АЛ воспроизведен у 4 из 6 и у 1 из 3 морских свинок соответственно. Эти данные согласуются с тем, что в НИПМ: присутствие агента амиотрофического лейкоспонгиоза в культурах клеток на 1-е сутки исследования было зафиксировано только в 41,6 %, а на 7-е сутки — уже в 76,6 % наблюдений.


Рис. 9. Обнаружение агента амиотрофического лейкоспонгиоза непрямым иммунопероксидазным методом в культурах диссоциированных нейронов спинного мозга эмбриона крысы: а — зараженная агентом АЛ, б — контрольная

Таблица 4. Результаты исследования культур клеток диссоциированных нейронов эмбриона крысы, зараженных агентом АЛ

Животных заражали ретробульбарно, в оба глаза по 0,5 мл (всего 1 мл) культуральной жидкости, по 0,2 мл (всего 0,4 мл) гомогената клеток
Исследованы гомогенат клеток (первый ряд данных) и культуральная жидкость (второй ряд)

Культуры клеток головного мозга исследованы только на 7-е сутки. АЛ удалось воспроизвести лишь у 1 из 3 животных, зараженных гомогенатом клеток. Обращает на себя внимание длительный инкубационный период, предшествующий заболеванию инокулированных животных. По-видимому, это частично обусловлено небольшими дозами введенного материала, поскольку получение таких культур чрезвычайно сложно и трудоемко. Поэтому с целью расчета титра агента амиотрофического лейкоспонгиоза по длительности инкубационного периода для этой системы необходимы дальнейшие исследования, чтобы накопить большой фактический материал.
Таким образом, агент амиотрофического лейкоспонгиоза способен персистировать и размножаться в диссоциированной культуре нейронов эмбрионов крысы. Из культур клеток, приготовленных из разных отделов ЦНС, наиболее «чувствительные» культуры клеток получены из спинного мозга.