Содержание материала

С целью изучения возможности пассирования агента амиотрофического лейкоспонгиоза в перевиваемых культурах были использованы различные линии клеток (L, L-41, FL, CV-1, Vero, Не- 1а, диплоидные клетки легкого и почки человека, Нер-2), в которые вносили жидкость с первичных культур клеток мозга больных, погибших от амиотрофического лейкоспонгиоза.
Изменения, аналогичные описанным выше изменениям первичных клеток мозга, были выявлены лишь в клетках Нер-2. После внесения агента амиотрофического лейкоспонгиоза в систему клеток Нер-2 в последней не только появлялся феномен гемадсорбции, но и в 2—5 раз увеличивалась митотическая активность клеток. Кроме того, «урожай» зараженных клеток на 3-и сутки увеличивался в 2—4 раза, а число живых клеток на 10—12 % было ниже по сравнению с контролем (рис. 10). Развитие цитодеструктивных изменений в клетках не наблюдали. Синтез клеточных макромолекул (РНК, ДНК, белка) также возрастал в 2—3 раза. Увеличение митотической активности и «урожая» зараженных клеток было одинаковым при сравнении культур клеток Нер-2, зараженных как культуральной жидкостью, свободной от клеток, которая получена от первичных культур клеток мозга людей, погибших от амиотрофического лейкоспонгиоза, обезьян и других лабораторных животных с экспериментальной болезнью, так и гомогенатом клеток этих мозговых культур. Предполагаемый титр агента амиотрофического лейкоспонгиоза, определенный в реакции гемадсорбции, соответствовал титру, который установлен по митотической активности (табл. 5).

После заражения клеток Нер-2 цельной суспензией, содержащей агент амиотрофического лейкоспонгиоза, всегда значительно повышается митотическая активность клеток (различье достоверно, Р<0,001), в сравнении с контролем. 

Рис. 10. Количество клеток Нер-2, зараженных агентом АЛ, и про цветное содержание мертвых клеток в разное время культивирования:
1, 3 — опыт; 2, 4 — контроль

В следующие трое суток она практически оставалась на одном уровне. После заражения клеток агентом АЛ в разведении 10 1 на 2-е сутки достоверно снижается митотическая активность (по сравнению с 1-ми сутками, Р<0,()01), а на 3-и сутки снова повышается до прежнего уровня. Чем ниже концентрация агента в инокулируемом материале при инфицировании клеток Нер-2 (разведения 10-2- 10-4), тем позднее повышается митотическая активность, коррелирующая с результатами гемадсорбции.
Результаты исследований зараженных агентом АЛ клеток Нер-2 в динамике показали, что митотическая активность в сравнении с контролем через 4 ч после внесения агента увеличивается (в 2 раза и более) и остается такой в течение всего наблюдения до 5 суток (рис. 11).

Таблица 5. Митотическая активность
 и интенсивность гемадсорбции с эритроцитами крови человека группы 0 (I) в культуре клеток Нер-2, зараженной агентом АЛ

Примечание. В качестве контроля ткани использованы клетки Нер-2, обработанные культуральной жидкостью, которые получены из культуры клеток мозга больного, погибшего от травмы.
* — различия по сравнению с контролем достоверны, Р <0,001.------------------ нет гемадсорбции. Интенсивность гемосорбции выражена в крестах

Как видно из рисунка, изменения митотической активности зараженных клеток в течение суток в основном соответствуют изменениям контрольных клеток Нер-2. Очевидно, под влиянием агента амиотрофического лейкоспонгиоза синтез клеточных макромолекул не подавляется, а, наоборот, усиливается способность клеток Нер-2 к пролиферации. Возможно, что обнаруженные в зараженных агентом АЛ клетках Нер-2 изменения связаны с персистирующим в них онковирусом типа D. Путем сопоставления митотической активности контрольной и инфицирован ной культур клеток Нер-2 можно выявить 4 зоны значительного повышения митотической активности клеток на 4—5-м, 13 — 15-м, 19-м и 22-м ч культивирования, которые, по-видимому, отражают закономерности репродукции агента амиотрофического лейкоспонгиоза в данной системе клеток. Поскольку механизмы репродукции агента амиотрофического лейкоспонгиоза, как и других неклассических вирусов, пока не выяснены, трудно дать исчерпывающую интерпретацию полученных данных.


Рис. 11. Изменения митотической активности клеток Пер-2, зараженных агентом АЛ:
а — митотическая активность незараженных (светлые кружочки) и зараженных (темные кружочки) клеток; б — соотношение митоза в незараженной и зараженной культурах клеток

Возможно, что феномены гемадсорбции и повышения митотической активности клеток Нер-2, возникающие после внесения агента амиотрофического лейкоспонгиоза, косвенно свидетельствуют о его репродукции в данной системе клеток. В связи с тем, что появление этих признаков инфекции зависело от концентрации внесенного агента, по ним можно было определять активность агента в культуре клеток. Если активность агента амиотрофического лейкоспонгиоза в определенной степени коррелировала с образованием в цитоплазме мозговых культур клеток вакуолей и увеличением числа пораженных клеток, то никакой корреляции между активностью агента и цитопатическим эффектом, которые определялись в мозговых культурах клеток, не отмечалось.
Как уже отмечалось выше, при культивировании агента амиотрофического лейкоспонгиоза в клетках Нер-2 цитопатическое действие (ЦПД) не развивалось. Однако после 15—20-го пассажа его активность резко снижалась, а нередко обнаружить агент амиотрофического лейкоспонгиоза вообще не удавалось. Возможно, что агент амиотрофического лейкоспонгиоза способен активно размножаться с развитием ЦПД лишь в немногих перевиваемых клетках и в течение ограниченного времени. В результате он постепенно элиминируется из культуры клеток. Однако, персистируя в других перевиваемых клетках без развития продуктивной инфекции, например в клетках, выделяющих онковирус D типа, возбудитель амиотрофического лейкоспонгиоза способствует активному делению клеток без видимых изменений. Повышение числа мертвых клеток в инфицированных культурах по отношению к контрольным, по-видимому, подтверждает это предположение.
В очагах повышенной пролиферации клеток Нер-2, зараженных агентом АЛ, определялась адсорбция эритроцитов человека крови группы О (I) и макаки-резус, которая перекрестно ингибировалась сыворотками людей, больных амиотрофическим лейкоспонгиозом, и белкообразной обезьяны с экспериментальной болезнью. Способность этих сывороток ингибировать гемадсорбцию не исчезла после обработки их сульфатом аммония с целью удаления иммуноглобулинов. Антитела к агенту амиотрофического лейкоспонгиоза методом флюоресцирующих антител и в реакциях иммунодиффузии в геле, связывания комплемента и нейтрализации в сыворотках крови больных амиотрофическим лейкоспонгиозом и экспериментально зараженных животных выявить не удалось. Однако феномен ингибирования гемадсорбции был строго специфичен и не отмечался при использовании сывороток больных амиотрофическим боковым склерозом, БКЯ, болезнью Шильдера и другими болезнями нервной системы, в том числе вирусными, а также сывороток доноров крови. Ингибирующий гемадсорбцию фактор в свежих сыворотках крови больных амиотрофическим лейкоспонгиозом действовал после внесения в инфицированную культуру клеток в разведении 1 : 10—1 : 20. Однако вследствие длительного хранения и многократного «замораживания — оттаивания» его активность постепенно снижается и полностью исчезает. Этот фактор разрушался также при нагревании до 95 °C в течение 5 мин. Обычными биохимическими и биофизическими исследованиями, такими как гельфильтрация, хроматография, не удалось определить молекулярную массу фактора и получить его в очищенном виде.
Данные предварительных исследований показали, что сывороточный фактор ингибировал активность всех выделенных штаммов агента амиотрофического лейкоспонгиоза (это подтвердилось как реакцией ингибирования гемадсорбции, так и блокированием повышения митотической активности клеток), по по влиял на репродукцию представителей семейства герпесвирусов (вируса простого герпеса) и ретровирусов (онковируса типа С — вируса лейкоза крупного рогатого скота и онковируса типа D — вируса Ильина— Быковского) в перевиваемых монослойных культурах клеток.