4. Метод флюоресцентного окрашивания.
Толстые мазки свежих фекалий высушить на воздухе, провести через раствор аурамина с фенолом, промыть водой и быстро окрасить (5—10 мин) в растворе карболового фуксина. После промывания водой высушить на воздухе и исследовать с помощью люминесцентного микроскопа (лучше с иммерсионной системой).
Результаты: Ооцисты криптоспоридий имеют вид ярко флуоресцирующих дисков, отчетливо заметных на темно-красном фоне.
IV. Методы обогащения: флотация и седиментация.
В качестве флотационных жидкостей используют насыщенные растворы хлорида натрия или сахарозы, насыщенный раствор сульфата цинка (331 г nSО4.7H2О растворить в 1 л водопроводной воды). Для флотации используют также среду Бреза (смесь насыщенных растворов сульфата магния и тиосульфата натрия и водопроводной воды в соотношении 3:3:1), смесь Павлесека (хлорид цинка — 220 г, хлорид натрия — 210 г, водопроводная вода— 800 мл) и др.
1. Флотация с центрифугированием.
Центрифугирование ускоряет процесс флотации ооцист, а также позволяет отмывать фекалии, сводя до минимума загрязнение препарата жиром или детритом. При отмывании фекалий их разбавляют водой, а не флотационной жидкостью, и процеживают в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Исследуемый материал необходимо центрифугировать в течение 1—2 мин при 2—3 тыс. об/мин или 3—4 мин при 1500 об/мин. После первого (отмывочного) центрифугирования супернатант удалить, при этом объем оставшегося осадка не должен превышать 1 мл. Добавить в пробирку флотационную жидкость на половину ее объема и ресуспендировать в ней осадок с помощью пипеток с резиновым баллоном или стеклянной палочки. Затем долить флотационную жидкость до верхнего края пробирки и центрифугировать повторно в том же режиме; в результате ооцисты сконцентрируются в поверхностной пленке жидкости. Материал с этой пленки собрать металлической петлей или стеклянным капилляром, нанести на предметное стекло, фиксировать смесью Никифорова и окрасить соответствующим методом, после чего подвергнуть микроскопии.
2. Методы седиментации.
Обычно применяют седиментацию эфиром, для чего 0,5—1,0 г фекалий необходимо смешать с 10—12 мл изотонического раствора хлорида натрия. Тщательно перемешанную суспензию процедить через 2 слоя марли в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Осадок дважды промыть изотоническим раствором при центрифугировании, затем тщательно ресуспендировать в 10 мл 10% раствора формалина, добавить 3 мл эфира и тщательно перемешать; предварительно закрыв пробирку пробкой. Полученную смесь центрифугировать в течение 2 мин при 1 тыс. об/мин. Эфир, поверхностный детрит и формалин слить, а из оставшегося на дне пробирки осадка сделать мазки и окрасить одним из описанных ранее методов.
При модифицированном методе эфирной седиментации 0,5 мл жидких фекалий смешать с 3 мл 10% раствора формалина и размешать до получения гомогенной суспензии. Добавить 30 мл этилового эфира и тщательно перемещать путем встряхивания, затем добавить 15 мл 10% раствора формалина, перемешать и процедить полученную смесь через марлю в центрифужную пробирку. Конец пипетки с резиновым баллоном осторожно (не касаясь стенок пробирки) опустить ниже слоев эфира и детрита, отсосать нижний столбик жидкости и перенести его в другую пробирку. Новую пробирку долить 10% раствором формалина и центрифугировать в течение 10—15 мин. при 3 тыс. об/мин (длительность центрифугирования пропорциональна вязкости раствора), из осадка приготовить мазки и окрасить их одним из обычных способов.
V. Биопробы на мышах
Для постановки биопроб необходимо скормить небольшие порции фекалий новорожденным или 2—5-дневным белым мышам. При наличии в пробах ооцист криптоспоридий в фекалиях мышей через 5—8 дней будут обнаруживаться ооцисты. При вскрытии мышей в более ранний период (оптимально на 3—7-й дни) в гистологических препаратах кишечника (предпочтительно, в препаратах подвздошной кишки) будут выявляться эндогенные стадии развития криптоспоридий, локализующиеся в зоне щеточной каемки.
При постановке биопроб на животных можно к гомогенату фекалий добавлять антибиотики (пенициллин, стрептомицин, гентамицин), которые подавляют сопутствующую микрофлору, но не влияют на инвазивность ооцист криптоспоридий.
Количество ооцист криптоспоридий подсчитывают с помощью камеры Горяева, используемой в гематологической практике. После инкубации, стимулирующей эксцистирование ооцист, можно таким же способом подсчитать и количество спорозоитов.
Для количественных определений можно также подсчитывать общее количество ооцист в окрашенном мазке, приготовленном из определенного количества фекалий (например, из 0,2 г).
Под редакцией профессора Фролова В. М.
Доктор медицинских наук Пересадин Н. А., профессор Федченко С. Н., ассистентом Бакланова А. В.