Содержание материала

И от чего же умер ваш друг?
О, причина естественная.
Его застрелили в подземке.
Из фольклора города Нью-Йорка

Беспрецедентный интерес мировой научной общественности к проблеме свободных радикалов (СР) в связи со старением возник сравнительно недавно, в начале 90-х годов XX в., и был вызван публикацией серии эффектных молекулярно-генетических исследований, однозначно указывавших на значительную роль CP-форм кислорода в ускорении процесса старения организмов (Растинг. 1993), хотя предпосылки для таких заключений, базирующихся на ином фактическом материале, существовали в научной литературе уже давно (Harman, 1956; Эмануэль, 1963; Эмануэль и др., 1977). Средства массовой информации (СМИ) США, придавая сенсационный характер этим новым результатам американских ученых и пытаясь донести до широкой публики их значение для медицины и здравоохранения, настойчиво обращались к весьма наглядной аналогии между ролью СР в живых системах и социальными аспектами преступности в современном демократическом обществе. Действительно, американцы, гордящиеся своим свободолюбием, убеждены, что не существует такого понятия, как “слишком много свободы”. Конечно, свобода - великая вещь, если она осуществляется в рамках разумных законов, которые защищают человеческую жизнь, права и собственность. Преступники, наоборот, пытаются пользоваться абсолютной, безграничной свободой, нанося вред своим согражданам и обществу в целом. Итак, несмотря на свою любовь к свободе, цивилизованные люди делают то, что они должны делать, чтобы защитить себя: голосуют за жесткие законы против преступлений, требуют увеличения количества полицейских на улицах и, конечно, покупают домашние системы безопасности и оружие. Дело в том, что, нуждаясь в свободе, мы также нуждаемся и в защите от слишком большой свободы в чужих руках... СМИ не скупились в выражениях, подчеркивая явную аналогию между поведением СР в организме и поведением преступников в сообществе. Но какова химическая и биохимическая природа свободных радикалов?
Хотя этим вопросам в дальнейшем и будет уделено достаточно много внимания, здесь мы ограничимся лишь несколькими замечаниями. Свободные радикалы - это химические соединения с неспаренными электронами, которые обладают чрезвычайно высокой реакционной способностью, которая реализуется случайным образом. Большинство химических соединений в организме реагирует друг с другом относительно медленно и в пределах некоторых правил, которые определяют направление и скорость химических реакций, определяющих многообразные функции клеток и организма в целом. Эти правила осуществляются с помощью специальных белков (ферментов), которые облегчают и ускоряют химические реакции. Не так обстоит дело со СР. Эти “бандиты” реагируют быстро и беспорядочно с любыми клеточными структурами, которое встретятся на их пути, результатом чего становятся разнообразные повреждения.
Отдав должное современному всплеску интереса к роли СР в биологических явлениях и перед тем, как перейти к ее рассмотрению по существу, нам хотелось, хотя бы кратко, осветить историю этой проблемы.
СР или атомы, в отличие от молекул, обладают свободными ненасыщенными валентностями, что определяет легкость их взаимодействия с другими молекулами, при этом происходит разрыв одной из валентных связей последних и всегда образуется новый СР. Этот СР в свою очередь легко реагирует с другой исходной молекулой, вновь образуя СР и т.п. Совокупность этих элементарных актов называется разветвленной цепной реакцией. Еще в 1927-1929 гг. выдающийся российский ученый Н.Н. Семенов разработал теорию этих явлений в газовой фазе, показав существование нового класса реакций, а именно разветвленных цепных химических реакций (Семенов, 1934). Этот механизм лежит в основе таких явлений, как горение, взрыв, детонация. Широкой популярности теории цепных реакций способствовало открытие физиками цепного разветвленного механизма деления ядерного горючего (ядерного взрыва), в котором в качестве активных центров выступают нейтроны и принцип которого описывается свободнорадикальной теорией. Следует, однако, подчеркнуть, что цепные реакции в химических процессах были открыты Н.Н. Семеновым значительно раньше, чем это было сделано физиками в ядерных реакциях. Осознание этой ситуации мировой научной общественностью привело к тому, что в 1956 г. Н.Н. Семенову совместно с С. Хиншелвудом была присуждена Нобелевская премия по химии.
Если при изучении быстрых цепных разветвленных реакций в газовой фазе наметился крупный успех, то медленные цепные реакции в жидкой фазе, реакции типa “медленного взрыва”, были исследованы значительно меньше. В реакциях такого типа отсутствовали данные об образовании продуктов CP-характера. Этот пробел был восполнен учеником и последователем Н.Н. Семенова Н.М. Эмануэлем, который внес решающий вклад в обоснование теории медленных цепных реакций окисления органических веществ в жидкой фазе (Эмануэль, 1966). Наибольший интерес (в контексте этого раздела) представляют работы Н.М. Эмануэля и его сотрудников, посвященные природе CP-механизма окисления липидов (Эмануэль, Кнорре, Лясковская, 1957). В развитие этих работ были проведены обширные исследования окисления липидов в присутствии разнообразных ингибиторов (антиоксидантов)2  и их смесей с целью разработки способов повышения сохранности этих ценных пищевых продуктов (Эмануэль, Лясковская, 1961). Это направление исследований сыграло решающую роль в последующем распространении принципов цепного жидкофазного окисления на биологические системы, ибо основным компонентом мембран живых клеток, как известно, являются липиды. Согласно оригинальной и смелой гипотезе, предложенной независимо друг от друга Н.М. Эмануэлем и Б.Н. Тарусовым3, экстремальные внешние воздействия индуцируют в мембранах клеток цепные реакции окисления свободнорадикального характера.
Более того, в дальнейшем было высказано предположение , что с помощью разнообразных антиоксидантов можно, нейтрализуя СР, предотвратить развитие деструктивных процессов в таких важнейших структурах, как клеточные мембраны. Дальнейшие исследования Н.М. Эмануэля и его школы полностью подтвердили эту концепцию. Так, при изучении на высших животных таких патологических процессов, как лучевая болезнь, злокачественный рост клеток, действие токсических веществ, а также при старении или острых состояниях стресса организма наблюдалась активация (P-процессов перекисного окисления липидов. Наоборот, введение в организм специально подобранных или синтезированных для этой цели малотоксичных антиоксидантов снижало уровень СР и даже останавливало развитие патологических процессов и старения лабораторных животных (Бурлакова и др., 1975; Эмануэлы и др., 1977; Эмануэль, 1975; 1977; 1982; Обухова, Эмануэль, 1984; Бурлакова, Храпова, 1985). Именно эти работы, а также работы Д. Хармана (Harman, 1956; 1962; 1984) задолго до упомянутых выше молекулярно-генетических работ, выполненных на низших организмах, возвестили о начале эры широкого практического использования антиоксидантов в интересах здравоохранения.


1 Еще в 1825 г. английский исследователь Б. Гомпертц нашел, что после 30-35 лет у человека показатель удельной смертности увеличивается с возрастом экспоненциально (Gompertz, 1825). Исходя лишь из этого факта, многие биологи пытаются понять причины старения и смерти, хотя в математических корреляциях отражаются изменения, происходящие в популяции, а не те конкретные процессы, которые лежат в основе самого механизма старения и его проявлений у индивида.

2 Именно в этот период в научном обиходе школы Н.М. Эмануэля стал систематически использоваться термин антиоксиданты, столь хорошо известный сейчас не только широкой научной общественности, но и всему цивилизованному человечеству.

3 Б.Н. Тарусов, сравнивая особенности лучевого поражения во времени с кинетикой цепных химических реакций, описанных Н.Н. Семеновым, пришел к выводу, что протекающие в облученных живых системах процессы ускоряются со временем, подобно автокаталитическим цепным реакциям. Он предположил, исходя из имеющихся данных о структурной организации и физико-химических особенностях живых систем, что цепные процессы могут развиваться в липопротеиновой фазе клеточных структур и приводить в заключительной стадии к разрушению “фазовых границ” и к гибели клетки (Тарусов, 1954).

Генезис и виды СР.

Согласно предложенной Ю.А. Владимировым и его сотрудниками (1992) классификации, подавляющее большинство СР, образующихся в организме человека и животных, можно разделить на природные и чужеродные. Первые в свою очередь разделяются на первичные, т.е. продукты нормального метаболизма (ОО-; ΝΟ; HQ - супероксиды, нитроксиды и семихиноны - соответственно)1. Из супероксида, а также в результате ряда других реакций в организме могут образовываться такие активные продукты, как перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Реакции этих соединений с ионами металлов переменной валентности, главным образом с ионами Fe2+, генерируют образование вторичных радикалов (ОН; LO; L; LOO - радикал гидроксила и набор липидных радикалов - соответственно), которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры. Наконец, третичные радикалы -  это радикалы антиоксидантов, которые образуются при их взаимодействии с теми или иными из упомянутых выше радикалов.
Первичные и вторичные радикалы являются природными, поскольку в определенных количествах всегда образуются в наших клетках. Чужеродные радикалы могут появляться в клетках и тканях под воздействием ионизирующей и ультрафиолетовой радиации или в результате превращения каких-либо неприродных соединений (ксенобиотиков), попавших в организм высших животных.

1 Неспаренный электрон в радикалах принято обозначать точкой. Например, радикал гидроксила обозначают НО.

Активные формы кислорода (АФК).

Важнейшим достижением органической эволюции на Земле стало формирование фотосинтеза, а именно способности простейших живых систем к усвоению свободной энергии солнечной радиации. Фотосинтез фактически создал условия для гигантского роста органической массы, что, наряду с обогащением атмосферы свободным кислородом, обусловило будущее возникновение и развитие бесконечного множества одно- и многоклеточных аэробных форм жизни. Между тем уже существовавшие формы жизни подверглись при этом серьезной опасности окислительной деструкции и были вынуждены эволюционировать по пути выработки адаптационных приспособлений, ограничивающих токсический эффект кислорода. Благодаря выработке и наследственному закреплению защитных антиоксидантных механизмов, обеспечивших организмам относительную стабильность, жизнь на Земле смогла успешно эволюционировать от ее простейших форм до человека. Центральную роль среди этих защитных механизмов занимает комплекс антиоксидантных ферментов - изоформы супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и пероксидазы (подробней об этих механизмах - далее ).
Следующим кардинальным успехом эволюции явилось создание дыхательных цепей, т.е. сложных энзиматических систем окислительного фосфорилирования энергетических субстратов, которые (у аэробных организмов) вовлекали кислород в процесс извлечения значительного дополнительного количества аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) - универсального аккумулятора - донора биологической энергии.
“Чистый выход” энергоносителей при полном окислении одной молекулы глюкозы до воды и СО2 составляет 38 молекул АТФ, синтезированных из аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) и неорганического фосфата. При этом две молекулы АТФ дает гликолиз (процесс анаэробного расщепления глюкозы), две молекулы АТФ - цикл Кребса (циклическое превращение органических кислот, включающее присоединение двууглеродистого фрагмента от ацетил-КоА к щавелево-уксусной кислоте и два последовательных акта окислительного декарбоксилирования: щавелево-уксусная → лимонная → a-кетоглютаровая → янтарная → фумаровая → яблочная → щавелево-уксусная кислота → и т.п.), а 34 молекулы АТФ (!) поступают из дыхательной цепи (рис. 2).


Рис. 2. Схема гликолиза и аэробного дыхания (Грин и др., 1990)

Столь крупный энергетический выигрыш, который получили организмы в результате приобретения механизма окислительного фосфорилирования, послужил мощным толчком для формирования и совершенствования новых физиологических функций, например, различных видов двигательных реакций, дистантной рецепции, простых и сложных реакций нервной системы, систем переработки электрофизиологической и химической информации и, наконец, мышления.
Наряду с этим, деструктивный потенциал перекисного окисления был использован природой и для совершенствования ряда катаболических процессов, например, внутриклеточного пищеварения, фагоцитоза (Freeman, 1984; Гриневич и др., 1986), окислительной деструкции чужеродных и токсичных веществ (Арчаков, 1975), разборки избыточных мембранных структур (Yukawa, Nakazawa, 1980; Бурлакова, Храпова, 1985).
Все перечисленные выше эволюционные достижения (список которых далеко не исчерпан), открыв беспрецедентные возможности развития жизни на нашей планете, содержали тем не менее скрытые имманентные опасности для этой жизни.

Деструктивная роль АФК и ПОЛ.

Максимальная активность дыхательной цепи, которая локализована в многочисленных субклеточных органеллах, называемых митохондриями, сопряжена с опасными побочными эффектами. 

Известно, что около 98% кислорода, потребляемое митохондриями в процессе окислительного фосфорилирования, превращаются в воду, тогда как оставшиеся 2% диффундируют за пределы дыхательной цепи в виде анион-радикала супероксида О2 в результате флуктуаций в цепи электронного транспорта (ЦЭТ). Как это видно на рис. 3, супероксид-радикал может превращаться в перекись водорода (Н2О2) и радикал гидроксила (ОΗ). Все эти соединения (в особенности OΗ) способны нанести клеткам существенные повреждения. Увеличение потока электронов по дыхательной цепи от субстратов дыхательной цепи к кислороду будет с неизбежностью увеличивать и количество повреждений в клеточных структурах, поскольку будет повышать продукцию этих АФК. И такие ситуации будут постоянно повторяться в жизни любого аэробного многоклеточного организма. Поэтому в качестве защиты от агрессивных воздействий такого рода в клетках эволюционно закрепилась антиокислительная энзиматическая система, первым звеном которой является фермент супероксиддисмутаза (СОД), катализирующая реакцию дисмутации супероксидного радикала (Владимиров, 2000а):

Перекись водорода мигрирует в другие компартменты клетки и разрушается в результате действия других ферментов - каталазы и глутатионпероксидазы (GSH-пероксидазы), и таким образом происходит дальнейшая нейтрализация АФК:

Наряду с описанной энзиматической системой, в организме существует много природных соединений, обладающих антиоксидантными (АО) свойствами. Это прежде всего витамины А, С, Е, β-каротин, селен, глутатион, цистеин, метионин, мелатонин, токоферолы, убихиноны, ретиноиды, флавоноиды и многие другие соединения. Тем не менее, несмотря на такую сложную систему AO-безопасности, какое-то количество наиболее активных СР все-таки “ускользает” от факторов нейтрализации и наносят свои повреждающие удары. Повреждений будет тем больше, чем ниже АО-защита организма, ослабленная стрессом, недоеданием, преклонным возрастом или болезнями.
Заметную роль в развитии нарушений, вызванных АФК, играют также ионы двухвалентных металлов. Так, в присутствии ионов двухвалентного железа, которые всегда в тех или иных количествах содержатся в клетках, перекись водорода разлагается с образованием гидроксильного радикала:


Рис. 3. Пути переноса электронов в дыхательных цепях митохондрий (Скулачев, 1999)

Эта реакция, открытая Фентоном еще в позапрошлом веке (Fenton, 1894), чревата всевозможными неприятностями для живых клеток. Чрезвычайно высокая химическая активность радикала гидроксила позволяет ему разрушать практически любую молекулу, вступившую во взаимодействие с ним. Так, действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, НО вызывает их денатурацию и инактивацию ферментов. В нуклеиновых кислотах этот СР разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, следовательно, разрывает сахаро-фосфатный остов ДНК и РНК, что в ряде случаев приводит к гибели клеток. Внедряясь в липидный слой клеточных мембран, радикал гидроксила инициирует реакции цепного окисления липидов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и в конце концов к гибели клеток. Таким образом, радикал НО - это радикал-разрушитель, радикал-убийца (Владимиров, 2000а).
Как мы уже видели, реакция цепного окисления липидов, или, как ее еще часто называют, реакция перекисного окисления липидов (ПОЛ), играет важную роль в развитии многих патологических процессов, включая также и процесс старения (Эмануэль, Обухова, 1984; Бурлакова, Храпова, 1985; Дильман, 1987; Барабой, Брехман и др., 1992; Todorov Н. et al., 2001).
Попадая в липидный слой мембраны, радикал гидроксила (а именно он чаще других СР предпринимает подобную атаку) вступает в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (LH), образуя при этом липидные радикалы (Владимиров, Арчаков, 1972):

Липидный радикал (L) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, при этом возникает новый свободный радикал липоперекиси (LOO):

Этот последний атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L*:

Чередование двух последних реакций и представляет собой цепную реакцию пероксидации, т.е. реакцию ПОЛ. Значительное ускорение ПОЛ наблюдается в присутствии ионов двухвалентного железа. В результате взаимодействия Fe2+ с гидроперекисями липидов (разновидность реакции Фентона) происходит разветвление цепей:

Появившиеся радикалы LO инициируют новые цепи окисления липидов:

В клеточных мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Однако в конце концов они обрываются в результате взаимодействия СР с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности или друг с другом:

Мы сочли уместным столь подробно остановиться на реакциях перекисного окисления липидов, поскольку эти реакции играют, как это будет показано ниже, крайне важную роль в клеточной патологии при стрессе, развитии дегенеративных болезней, т.е. во всех тех случаях, которые в той или иной степени имеют отношение к процессам старения.

Одним из наиболее важных последствий повышенного образования АФК и цепных реакций ПОЛ является нарушения структуры и функции клеточных мембран, что не может не сказываться на нормальной жизнедеятельности клеток (рис. 4). В хрусталике глаза, например, ПОЛ приводит к окислению сульфгидрильных групп мембранных белков и далее к образованию дисульфидных мостиков между соседними белковыми молекулами, что способствует образованию массы белковых агрегатов и развитию старческой и других видов катаракты у человека.
Схема токсического действия продуктов перекисного окисления липидов на клетку
Рис. 4. Схема токсического действия продуктов перекисного окисления липидов на клетку (Барабой и др., 1992)
В клетках и в особенности в субклеточных органеллах митохондриях, где дыхательная цепь генерирует основную массу АФК, окисление тиоловых групп продуктами ПОЛ приводит к появлению в мембранах различных дефектов. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах сквозь такие “поры” в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии - ионы калия. Эти процессы повышают осмотическое давление внутри клеток и митохондрий и вызывают их набухание, что еще больше повреждает мембраны. Генерализация ПОЛ постепенно делает мембраны более твердыми, хрупкими и “протекающими”, лишая их способности нормально реагировать с окружающей средой.
Продукты ПОЛ могут также статистически поражать ион-транспортные ферменты, такие как Са2+ - АТФазы, окисляя тиоловые группы их активного центра. Эти события приводят к замедлению “откачивания” ионов кальция из клетки и одновременно к ускорению входа кальция в клетку, что сопровождается повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки.  Под влиянием ПОЛ мембраны митохондрий делаются проницаемыми для ионов водорода и кальция, в результате чего эти органеллы теряют способность к синтезу АТФ и клетка оказывается в условиях энергетического голода (Владимиров, 2000в). Итак, мы видим, каким образом АФК и продукты ПОЛ могу влиять на развитие возрастных патологий и скорость старения. Но это, конечно, еще не все.
Помимо систем, продуцирующих энергию, АКФ в состоянии поражать и многие другие системы клетки, например систему хранения и передачи наследственной информации (ДНК), а также такой важнейший биологический процесс, как биосинтез белков. Степень CP-повреждений будет, очевидно, пропорциональна интегральной скорости метаболизма, которая, по существу, определяется скоростью сжигания калорий. Известно, что скорость метаболизма крысы приблизительно в семь раз выше человеческой. Согласно существующим оценкам, количество “попаданий” СР в ДНК у крысы составляет примерно 105, а у человека соответственно только 104. Это, по-видимому, одна из причин (но не единственная), почему люди живут значительно дольше, чем крысы. Действительно, когда скорость метаболизма крыс понижается путем серьезного ограничения калорийности питания, продолжительность их жизни разительно увеличивается.
Связь между интенсивностью метаболизма и видовой продолжительностью жизни была отмечена еще в начале XX в. Так, М. Рубнер (Rubner, 1908) показал, что для многих видов животных количество кислорода, потребленное за всю жизнь, в расчете на единицу веса остается величиной постоянной:

где Ru — константа Рубнера, Т - продолжительность жизни, gо2 - интенсивность дыхания (скорость потребления кислорода на единицу веса). Это означает, по крайней мере для теплокровных животных, что чем больше животное поглощает кислорода на единицу веса, тем более короткой будет его жизнь. Действительно, отношение поверхности к объему у мелких животных значительно выше, чем у крупных, и, следовательно, иррадиация тепла с их поверхности будет существенно большей, чем у крупных животных, и для поддержания постоянной температуры тела они вынуждены “сжигать” в дыхательной цепи значительно большее количество калорий. Подобная ситуация, как это ясно в настоящее время, с неизбежностью оборачивается резким повышением продукции АФК с их разрушительным действием на структурные компоненты клетки, что и является одним из важнейших факторов, определяющих продолжительность жизни. Как считают эксперты в этой области (Зотин, 1993; Зотин и др., 2001), константа Рубнера может быть использована для определения видовой продолжительности жизни практически всех групп животных.
В клетке существуют две органеллы, содержащих ДНК: ядро и митохондрии. Ядро содержит большую часть генетического материала клетки, распределенного по хромосомам. Митохондрии, которые служат энергетическими станциями клетки, содержат весьма небольшую, но необходимую часть клеточной ДНК.
Таблица 1
Биосинтез ядерной и митохондриальной ДНК в печени облученных крыс ( Галкин, Тодоров Н., 1969) (Показатель удельной радиоактивности ДНК у необлученных животных принят за 100%)


Время после облучения, часы

Ядра

Митохондрии

Импульс/мин/мг ДНК

Необлученные

100

100

12

21

4.6

24

40

7.7

Оказывается, что АФК поражают митохондриальную ДНК (мтДНК) в десять раз чаще, чем ядерную ДНК клеток одной и той же ткани. Частично, это происходит, потому что основная масса АФК генерируется именно в митохондриях, где происходит окисление значительной части биохимического топлива. Кроме того, мтДНК не защищена так же хорошо, как ядерная ДНК, белками (гистонами) и репарационными системами (Miquel et. al., 1992; Wei et al., 2001). Свидетельства высокой уязвимости мтДНК впервые были получены еще в 60-х годах XX в. в работе А.П. Галкина и И.Н. Тодорова (табл. 1), в которой была показана исключительно высокая радиационная поражаемость биосинтеза мтДНК (по сравнению с биосинтезом ядерной ДНК) печени при γ-облучения крыс в сублетальной дозе (что фактически равноценно поражающему действию АФК). В прошлом десятилетии было найдено более ста мутаций мтДНК человека, и некоторые из них имели место при старении человеческих тканей. Это связывают, в частности, с возрастным снижениям содержания восстановленного глутатиона в митохондриях, что коррелирует с увеличением повреждений мтДНК в стареющих тканях (Wei et al., 2001)
Постоянное воздействие АФК снижает со временем способность митохондрий производить энергию. Похоже, что митохондрии - это субклеточная система, которая первой деградирует с возрастом. В результате клетки становятся метаболически менее активными, что ведет к уменьшению функциональной способности органов, понижению уровня адаптивных реакций и развитию возрастных болезней.

Стресс, по-видимому, вносит главный вклад в процесс "выгорания"  митохондрий. Он повышает спрос на энергию, и побуждает митохондрии работать напряженнее, что приводит к образованию большего количества побочных продуктов окисления - АФК. При длительном или интенсивном стрессе мембраны митохондрий настолько повреждаются АФК, что образуется “утечка” их содержимого, и это прерывает процесс производства энергии и ведет к возникновению еще большего количества свободных радикалов. Вся ситуация в конце концов выливается в непропорционально серьезные окислительные повреждения, что, как полагают, дает толчок к патологиям и ускоряет старение.
Столь важная роль митохондрий в развитии оксидативного стресса и его влияния на процесс старения позволили ряду исследователей говорить об уверенном становлении митохондриальной теории старения (Sastre et al., 2000; Wei et al., 2001) (подробнее об этом см. в разделе “Оксидативный стресс клетки”, гл. 19).
Ключевая роль митохондрий в качестве энергетических станций клетки и ее специфическая восприимчивость к CP-повреждениям делают их важной потенциальной целью для вмешательства, направленного на замедление старения и снятия вредных последствий стресса. Два важных природных соединения испытывались для улучшения функций митохондрий: ацетил-L-карнитин (ALC) и коэнзим Q10 (CoQ-l0) (Modem Nutrition in Health and Disease, 1994). ALC - часть механизма транспортировки жирных кислот в митохондрии. Хотя ALC может синтезироваться в организме, скорость его синтеза снижается с возрастом Препараты с ALC ускоряют использование жиров митохондриями улучшая производство энергии. Некоторые исследования показали, что ALC понижает уровень холестерина, увеличивает уровень ЛВП и улучшает состояние коронарных сосудов и мозговую функцию.
CoQ-10, будучи существенной частью клеточной системы дыхания, локализованной в митохондриях, является также и антиоксидантом. CoQ-10 повышает как скорость, так и эффективность производства энергии, и в то же время защищает митохондрии от АФК. Организм может производить CoQ-10, но множество факторов, включая возраст, болезни, лекарства, понижающие холестерин, и, наконец, недоедание, могут снижать эту способность. CoQ-10 иногда называют “биомаркером старения”, потому что его уровень очень хорошо коррелирует со старением и дегенеративными болезнями. В одном из исследований добавки CoQ-10 привели к продлению жизни у мышей на 50%. Многие исследования ясно показали эффективность CoQ-10 при остановке сердца в результате закупорки сосудов и других болезнях сердечной мышцы. Другими патологиями, при которых, по-видимому, помогает CoQ-10, являются гипертония, снижение иммунитета и мышечная атрофия (Todorov Н. et al., 2001).
Белки клеток постоянно повреждаются в результате атак со стороны АФК и продуктов ПОЛ. Повреждения и модификации белков, как правило, необратимы, и эти белки подлежат удалению системами протеолиза, т.е. лизосомами, протеасомами и другими протеолитическими факторами (Рязанов, 2001). Восстановление необходимого набора белков связано с эффективной работой белок-синтезирующей машины, т.е. рибосом, информационных и транспортных РНК (иРНК, тРНК), аминоацил-тРНК-синтетаз, факторов трансляции и т.п. Все эти макромолекулы и их комплексы, связанные с катаболическими и анаболическими процессами, обновляющими белковый гомеостаз клетки, также подвергаются деструктивному воздействию СР. Постепенное накопление поломок в результате этого приводит к затуханию процессов обновления клеточных структур преимущественно за счет понижения скорости синтеза белков (Van Remmen, et. al., 1995). Это затухание в свою очередь связано, в частности, с возрастным уменьшением концентрации функционально активных рибосом, в основе чего лежит не только окисление собственно рибосомных белков, но и возрастное падение количества генов рибосомных РНК (рРНК) путем делеции некоторой их части из R-оперонов генома (Strehler, 1986; цит. по: Рязанов, 2001). Таким образом, одна из старейших концепций старения, а именно концепция затухающего самообновления протоплазмы (Нагорный, 1940; Нагорный и др., 1963), наконец, обретает причинно- следственную мотивацию в свете современных достижений в изучении деструктивной роли АФК и продуктов ПОЛ.
Таким образом, окислительные повреждения специфических белков составляют один из механизмов, связывающих оксидативный стресс с возрастной деградацией физиологических функций клетки (Sohal, 2002).
Окисленные белки, будучи термодинамически неустойчивыми, принимают частично развернутую третичную структуру, которая с готовностью формирует агрегаты, что способствует накоплению так называемых клеточных шлаков, в частности амилоида (подробнее см. в параграфе “Накопление шлаков” этой главы). Поэтому представляет интерес идентификация тех чувствительных к окислению белковых субстратов, которые могут играть защитную роль, благодаря их способности к регуляции, понижающей (down-regulate) энергетический метаболизм и последующую генерацию АФК. Как известно, поддержание клеточных градиентов кальция требует значительного расхода энергии, что, естественно, связывает изменения во внутриклеточном уровне кальция с утилизацией АТФ и ассоциировано с генерацией АФК при функционировании дыхательных механизмов. Избирательное окисление или нитрирование кальций регулирующих белков - кальмодулина и Са-АТФазы in vivo, которое имеет место в процессе старения в условиях оксидативного стресса, может представлять адаптивную реакцию на этот вид стресса, функционирующую по down-regidate энергетическому метаболизму, что связано с пониженной продукцией АФК. Эти кальций регулирующие белки также предпочтительно окисляются или нитрируются и в экспериментах in vitro, что укрепляет представление об их защитной роли. Сокращение скорости генерации АФК при этом минимизирует неизбирательное окисление ряда макромолекул, когда белковая репарация и системы протеолиза не способны предотвратить агрегацию. Таким образом, имманентные клеткам окислительные модификации кальций регулирующих белков, функционирующих в режиме down-regulate использования АТФ и генерации
АФК, могут ослаблять накопление окислительного “груза” при перманентно повторяющемся оксидативном стрессе (Squier, 2001). Таков еще один из механизмов, защищающих клетки от деструктивного влияния свободнорадикальных форм кислорода.
Деструктивная роль АФК и ПОЛ проявляется не только на субклеточном, но, естественно, также и на системном уровнях. Если, например, умеренная окислительная модификация гемоглобина повышала его расщепление мультикаталитической протеинкиназой, то длительная инкубация этого белка с оксидантом вызывала его повреждение с образованием перекрестных сшивок редуцирующими сахарами (см. параграф “Глюкоза и старение”) и продуктами ПОЛ со сложной, как правило, неопределенной структурой, что значительно снижало чувствительность этого белка к протеолизу. Это может, как полагают авторы, приводить к возрастанию уровня белков с повышенной антигенностью в тканях (см. гл. 6) и тем самым увеличивать риск развития аутоиммунной патологии при старении (Плешакова и др., 2000).
СР и старение организма. Идея о том, что свободные радикалы могут способствовать старению была впервые выдвинута Денхэмом Харманом в середине 50-х годов XX в. (Harman, 1956). Долгое время эта идея представлялась просто любопытной гипотезой. В последние два десятилетия, однако, ученые накопили большое количество аргументов в пользу этой идеи, превратив ее в одну из наиболее обоснованных современных теорий старения.
Существует множество прямых доказательств, что СР-повреждения накапливаются с возрастом. Например, у старых крыс обнаруживается вдвое больше окислительных, т.е. вызванных АФК, повреждений в ДНК, чем у молодых животных (Виленчик, 1987). Частота мутаций в лимфоцитах пожилых людей приблизительно в 9 раз выше, чем в лимфоцитах новорожденных (Curtsinger et al., 1995). Синдром Вернера и прогерию, две человеческих болезни, внешние симптомы которых указывают на преждевременное старение, связывают со значительным увеличением повреждения белков свободными радикалами (Ames et al., 1993). Возрастное накопление в клетках таких пигментов, как липофусцин и цероид, как полагают, являются также результатом окислительного повреждения белков и липидов. До определенного момента эти пигменты относительно доброкачественны, но если их накопление превышает некоторый уровень, клетки начинают “задыхаться” (Yin, 1996). Эта вредоносная аккумуляция пигментов может быть замедлена антиоксидантами
Однако наиболее интересные свидетельства взаимосвязи АФК и старения были получены при изучении СОД, которая была открыта Дж. Мак-Кордом и И. Фридовичем в 1969 г. (McCord et al., 1979). Осознание того факта, что существует фермент, катализирующий реакцию взаимодействия двух супероксидных радикалов и, следовательно, удаляющий АФК, и специально вырабатывающийся для этого клетками большинства животных, стимулировало исключительный интерес как к выяснению генезиса и функциональной роли радикалов кислорода, так и защитной роли этого фермента.
Эффектные генетически исследования некоторых низших организмов и их мутантов-долгожителей, о которых упоминалось в начале этого параграфа, содержали весьма убедительные доказательства связи между старением и активностью АФК. Было обнаружено, что мутации, поражающие определенный ген (называемый “age-1") у червей вида Caenorhabditis elegans, дают увеличение продолжительности жизни на 70%. Оказалось, что у этих мутантов уровень активности двух ключевых ферментов, нейтрализующих АФК-СОД и каталазы - был существенно повышен. Предполагалось, что ген, пораженный мутациями, кодирует структуру ингибитора антиоксидантной системы клетки (Finch, Jonhson, 1989). При обсуждении аналогии между функциональной ролью СОД у человека и червей, один из авторов этой работы Томас Джонсон привел известный афоризм Фридриха Ницше из его поэмы “Так говорил Заратустра” о том, что... люди, проделав свой путь от червя к человеку, во многом остались червями.

В другом случае, исследователи производили селекцию в последовательных генерациях плодовой мушки (Drosophila melanogaster), что позволило отобрать клон, особи которого показали вдвое большую, чем обычная, продолжительность жизни. Одно из важных различий между обычными и долгоживущими насекомыми заключалось в том факте, что у последних наблюдался более высокий уровень экспрессии гена, кодирующего СОД (Rose, 1991).
Исследование связи между старением и уровнем активности антиоксидантных ферментов у людей также позволило получить ряд косвенных свидетельств существования коррелятивной связи между этими параметрами. Так, у пациентов с синдромом Дауна, был обнаружен низкий уровень активности СОД (Brooksbank et al., 1983). И если вспомнить, что люди, страдающие этим заболеванием, живут, как правило, не более 35-40 лет, то, естественно, возникает мысль о непосредственной связи между пониженной активностью СОД и потенциальной продолжительностью жизни этих больных. В другой работе изучалось соотношение активности СОД и основного обмена (количество кислорода, используемого в процессах окислительного фосфорилирования) 12 видов приматов и человека. Обнаружилось, что чем выше продолжительность жизни разных видов, тем, соответственно, выше у них соотношение - активность СОД/основной обмен (Tolmasoffex al., 1980).

Защита от вредного действия свободных радикалов (Растинг Р., 1993)
АНТИОКСИДАНТЫ (нейтрализуют свободные радикалы или, иначе, ограничивают их активность)


Класс веществ

Вещество

Активность

Ферменты

Супероксиддисмутазы
Глутатионпероксидазы и каталазы

Превращает супероксидный радикал (О2) в перекись водорода (Н2О2)
Превращают перекись водорода в воду (Н2О) и молекулярный кислород (О2)

Другие

Витамин Е и β-каротин
Мочевая кислота и витамин С
Хелатирующие агенты

Взаимодействуют со свободными радикалами, тем самым не давая им влиять на клеточные компоненты; будучи жирорастворимыми, могут защищать мембраны
Взаимодействуют со свободными радикалами в цитоплазме
Не дают железу, меди и другим переходным металлам участвовать в катализе окислительных реакций

СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ (осуществляют деградацию, восстановление или замену поврежденных молекул)


Репарация белков

Протеиназы

Расщепляют окисленные белки

 

Пептидазы

Расщепляют продукты протеиназной активности; образующиеся аминокислоты могут использоваться для синтеза новых белков

Репарация липидов

Фосфолипазы

Расщепляют поврежденные участки окисленных липидов в составе мембран, так что другие ферменты могут заменить эти участки

АНТИОКСИДАНТЫ
(нейтрализуют свободные радикалы или, иначе, ограничивают их активность)


Класс веществ

Вещество

Активность

 

Ацетилтрансферазы
Глутатионпероксидаза и глутатион-трансфераза

Заменяют жирные кислоты, отщепленные от липидных молекул
Участвуют в замене окисленных жирных кислот без удаления крупных участков мембран

Репарация
ДНК

Экзонуклеазы и эндонуклеазы

Выщепляют поврежденные участки ДНК

Гликозидазы и полимеразы
Лигаза

Заполняют пустые места, оставленные экзо- и эндонуклеазами "Сшивает" восстановленные участки с остальной цепью

Считается, что быстрое увеличение максимальной продолжительности жизни у приматов и человека в течение последних нескольких миллионов лет было обусловлено, в частности, усовершенствованием генов систем защиты (Cutler, 1978, 1984). Нельзя не вспомнить в связи с этим высказывание одного из основоположников современной генетики Томаса Моргана: “У нас нет достаточных оснований допускать, что эволюция происходит прежде всего за счет увеличения числа генов у высших форм... главную роль играет не число появляющихся новых генов, а их виды"  (Morgan, 1932).
В начале развития радиобиологии, науки, изучающей влияние радиации на биологические системы, исследователи столкнулись с парадоксальным явлением. Низкий уровень лучевого воздействия защищал животных от более высоких уровней радиации так же, как и от многих других стрессоров - мутагенов, токсинов и АФК. Позже было найдено, что непродолжительное повышенное воздействие СР, вызванное радиацией, стимулирует антиокислительную защиту (АО-защиту) клеток (СОД, каталазу, глутатионпероксидазу), улучшая таким образом сопротивляемость к повреждающим агентам в будущем. По-видимому, на основе стимуляции этих же механизмов малые дозы ионизирующего облучения снижают, как было показано (Балакин и др., 2000), рост цитогенетических нарушений, обусловленный старением, до уровня ниже спонтанного, т.е. переводят организм в новое устойчивое состояние, характеризующееся повышенной стабильностью генома и, как следствие, увеличением продолжительности жизни.

Мы, естественно, не рекомендуем поселяться поближе к атомным электростанциям для приобретения лучшей сопротивляемости к стрессовым воздействиям. К счастью, имеется намного более простое решение. Умеренная физическая нагрузка также смягчает воздействие СР. Это понятно: чем большее количество топлива сжигает организм, тем больше образуется побочных продуктов окисления. С одной стороны, разумная периодическая физическая нагрузка стимулирует собственную антиоксидантную систему, которая останется улучшенной еще долгое время после окончания нагрузок. С другой стороны, чрезмерная нагрузка, которая является серьезным физическим стрессором, может сокрушить защитные системы и ускорить старение.

Защита от СР.

В III части этой книги будут представлены развернутые рекомендации по биохимической коррекции вредоносного влияния эндогенных СР. Здесь же мы ограничимся лишь несколькими предварительными замечаниями, которые в той или иной мере связаны с общим содержанием этого раздела.
Диета - очень важная часть поддержания полноценной АО-защиты. Во-первых, сбалансированная диета обеспечивает строительным материалом собственные системы организма, нейтрализующие СР. Витамины А, С, Е, как уже указывалось, сами по себе являются хорошими АО; аминокислота цистеин входит в состав глутатиона, основного внутриклеточного АО; медь, цинк и марганец необходимы для оптимальной функции СОД, а селен - для глутатион пероксидазы. Фрукты и овощи содержат большое разнообразие природных АО, включая многочисленные флавоноиды, каротиноиды и антоцианины. По-видимому, природные АО различаются как по их сродству к различным типам клеток или их органеллам, так и по их эффективности против определенных типов СР. Диета, изобилующая фруктами и овощами, обеспечивает, очевидно, наилучшую и всестороннюю АО-защиту. Множество исследований ясно показало, что такая диета уменьшает риск дегенеративных болезней. Современные рекомендации Национального института рака и Национальной академии наук США предлагают включать по крайней мере 2-4 порции различных фруктов (пример порции - одно яблоко среднего размера) и 3-5 порций различных овощей в дневном рационе. Хотя сбалансированная, богатая овощами и фруктами диета важна для продления жизни, опыт современной гериатрии показывает, что дополнительные антиоксидантные добавки, так же как и пищевые добавки, действующие против других механизмов старения, могут существенно продвинуть нас по пути улучшения здоровья и увеличения продолжительности жизни.
В табл. 2 суммированы основные клеточные механизмы, которые предотвращают или ликвидируют молекулярные повреждения, вызванные СР. Эти механизмы, как полагают многие исследователи, несовершенны и некоторые из них также теряют эффективность с возрастом.